Análise da variabilidade gênica de antígenos de T. cruzi com aplicação para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas.

A influência do metabolismo redox na transmissão da doença de Chagas

As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese.

Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Avaliação do efeito do benzonidazol sobre linfócitos, de portadores crônicos da doença de Chagas, submetidos experimentalmente à exposição ao Trypanosoma cruzi

O único medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas (DC) no Brasil é o benzonidazol (Bz). O beneficio da medicação aos portadores crônicos da doença ainda demonstra controvérsias, mas seu uso nessa fase pode ter a finalidade de prevenir/retardar a evolução da DC para formas mais graves. Os fenômenos imunológicos que ocorrem após a terapia com o Bz ainda não estão elucidados. Assim, este estudo propôs avaliar o efeito do Bz sobre o perfil imunológico de linfócitos T e a produção de citocinas por células da resposta imune expostas in vitro ao T. cruzi. Amostras de sangue de portadores crônicos da DC foram coletadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico com posterior infecção com tripomastigotas de T. cruzi, seguida de adição do Bz às culturas. Após o tempo de cultivo, os sobrenadantes foram estocados para posterior análise das citocinas IFN-gama, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 por CBA e as células foram avaliadas por citometria de fluxo, quanto à expressão das moléculas CD28+ e CTLA-4+ e a produção de citocinas (IL-10 e IFN-gama) em linfócitos T CD4+ e CD8+. Nossos resultados mostraram que o tratamento com o Bz aumentou a expressão da molécula CTLA-4+ em linfócitos T CD8+, indicando que o Bz pode induzir uma modulação da resposta imune e, consequentemente, diminuir a ativação exacerbada dessas células. Além disso, verificamos uma diminuição da produção da citocina IL-10 por linfócitos T CD4+ na presença do Bz. Com relação à produção global de citocinas por células aderentes e não aderentes, observamos que o Bz causou uma diminuição da citocina pró-inflamatória TNF e da citocina anti-inflamatória IL-10, enquanto que as outras citocinas (IFN-gama, IL-6, IL4 e IL-2) permaneceram com níveis elevados de produção na presença desse fármaco. Nossos resultados sugerem que o Bz induz uma regulação da ativação de linfócitos T CD8+ e a produção de citocinas do perfil Th1 modulado por citocinas do perfil Th2, em células de portadores crônicos da DC. Assim, acreditamos que a administração do Bz aos portadores de formas clínicas brandas da DC pode ser benéfica a esses pacientes, visto que o Bz não promoveu um perfil inflamatório exacerbado

Prevalência de soropositivos para Doença de Chagas em uma amostra da população de cães domiciliados da cidade de Porto Alegre

Resumo não disponível.

Soropositividade para doença de Chagas entre doadores de sangue em Araraquara, Estado de São Paulo, no período de 2004 a 2008

INTRODUÇÃO: A transfusão sanguínea é uma fonte potencial importante para transmissão da doença de Chagas. MÉTODOS: Foi verificado, nos arquivos do Hemonúcleo Regional de Araraquara, o resultado dos exames para doença de Chagas entre janeiro de 2004 e dezembro de 2008. RESULTADOS: Foram diagnosticadas com sorologia positiva 0,04% das 49541 doações de sangue realizadas. A idade dos soropositivos situou-se entre 51 e 60 anos. CONCLUSÕES: O baixo índice de doadores soropositivos pode reduzir o risco de transmissão via transfusional da doença de Chagas. A alta ocorrência de resultados inconclusivos indicam que os métodos diagnósticos devem ser melhorados.

Estudo de ovos de quatro espécies do gênero Meccus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae), vetores da doença de Chagas

The objective of this work was to analyze the morphological, morphometrical, and histological characteristics of eggs of four triatomine bugs species still not studied, in order to understand phylogenetic aspects and to facilitate parameters used in taxonomy, with the purpose of a specific and generic characterization of these vectors in public health. The eggs of each species had come from the collections of the Laboratory of Triatomine bugs and Culicid mosquitoes of the Faculdade de Saúde Pública - USP (Faculty of Public Health/USP). The morphologic studies were carried out through optic microscopy (OM) and scanning electronic microscopy (SEM). The eggs were measured with the help of the digital paquimeter Starrett® 727. In relation to histological measures, Microtome Leica RM 2145® was used. Similarities were evidenced in the exocorial architecture of the eggs when they were studied by OM and SEM. This similarity among the eggs suggests a recent speciation, probably derived from common ancestry, representing a monophyletic group. Some structures were also detected by the histological cuts. The study has contributed to the magnification and recognition in generic and specific terms of the Triatominae subfamily. These new data will be able to subsidize a better understanding to determine roles for each vector species and to facilitate parameters to be used in taxonomy.

Ánálise da capacidade funcional e da distribuição regional da ventilação pulmonar em pacientes com doença de chagas

INTRODUCTION: Cardiac and pulmonary manifestations of the Chagas disease (CD) affect between 20-30% of the infected subjects. The chronic Chagas cardiomyopathy (CCC) has some peculiarities such as arrhythmias and, especially heart failure (HF) and is potentially lethal due to left ventricular dysfunction. How respiratory disorders, patients get progressive loss of functional capacity, which contributes to a poor quality of life related to disease. Measurements of lung volume by the movement of the chest wall surface are an alternative evaluation of lung function and kinematics of complex thoracoabdominal for these patients. OBJECTIVE: evaluate the kinematics of the thoracoabdominal complex through the regional pulmonary volumes and to correlate with functional evaluation of the cardiorrespiratory system in patients with Chagas disease at rest. MATERIALS AND METHODS: a cross-section study with 42 subjects had been divided in 3 groups, 15 composed for patients with CCC, 12 patients with HF of different etiologies and 15 healthful presented control group. An optoelectronic plethysmography (POE), Minnesota questionnaire, six minute walk test, spirometer and manovacuometer was used. RESULTS: It was observed in the 6MWT where group CRL presented greater distance 464,93±44,63m versus Group HF with 399,58± 32,1m (p=0,005) and group CCC 404±68,24m (p=0,015), both the groups presented difference statistics with regard to Group CRL. In the manovacuometer 54,59±19,98; of the group CCC and 42,11±13,52 of group IC found group CRL presented 81,31±15,25 of the predicted versus, presenting in relation to group CRL. In the POE it observed a major contribution in abdominal compartment in patients with IC if compared like CCC and control groups. On the basis of the questionnaire of quality of life of Minessota, verified a low one groups CCC and IC 43,2±15,2 and 44,4±13,1, respectively (p<0,05) when compared with the control group (19,6±17,31). CONCLUSION: it seems that the patients with CCC possess same functional and respiratory characteristics, observed for the POE, 6MWT, manovacuometer and spirometer to the patients of group HF, being able to consider similar interventions for this complementary group as therapeutical of this neglected disease

Transplante cardíaco (TC): a experiência do portador da doença de Chagas

O sucesso do transplante cardíaco com portadores da doença de Chagas está condicionado a cuidados especiais durante todas as fases do transplante, com necessidade de acompanhamento específico e rigoroso pela equipe de saúde. Os receptores devem estar conscientes da permanência do Trypanossoma no organismo, e das possibilidades de reativação da infecção após o transplante. Portanto, seu conhecimento dessa condição, e a sua participação ativa no próprio tratamento, têm importância fundamental. O objetivo do estudo foi investigar a experiência do transplante cardíaco vivenciada por pacientes portadores da doença de Chagas, para buscar compreender os significados que eles atribuem a esta experiência. Os procedimentos metodológicos abrangeram: a seleção dos pacientes; as entrevistas; a análise dos dados, indicando as unidades de significado e a análise individual; a busca de convergências dos discursos; e análise hermenêutica das convergências. da análise dos dados emergiram os seguintes temas: o tempo vivido pelo receptor, portador da Doença de Chagas; a concepção do TC apresentado pelo portador de Chagas; o cuidado na trajetória do TC.

Doença de Chagas aguda pós-transfusional sem miocardite

Trata-se de paciente do sexo feminino, com 59 anos de idade, procedente de Itaporanga (SP), diabética e nefropata crônica, internada em virtude de surtos de pielonefnte e insuficiência renal aguda. Dentre outras medidas terapêuticas, recebeu transfusão de sangue. Cerca de dois dias após a última transfusão (sangue oriundo de doador, posteriormente identificado como chagásico) encontraram-se formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi em lâmina preparada para execução de hemograma. Iniciou-se tratamento com Benzonidazol. A paciente cursou para, pleuropneumonia e de secreção purulenta cirúrgica isolou-se Klebsiella spp. A septicemia conduziu a paciente ao êxito letal. Nenhuma lesão tecidual foi observada no miocárdio, no sistema nervoso central, adrenal ou nos demais órgãos examinados.

Doença de chagas e biologia de triatomíneos (Heteroptera, Triatominae), com ênfase aos aspectos da espermatogênese

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Doadores de sangue positivos em triagem sorológica para doença de Chagas no Acre: necessidade de adequação e orientação diagnóstica

O presente estudo, de que participaram 77.893 doadores de sangue que compareceram por primeira vez ao Hemocentro do Acre, de janeiro de 1997 a dezembro de 2008, teve por objetivos: 1) identificar indivíduos com sorologia positiva para doença de Chagas; 2) caracterizar, clinicamente, os indivíduos com sorologia positiva para doença de Chagas e 3) orientar adequadamente indivíduos com sorologia positiva quanto à terapêutica preconizada. A amostra se constituiu de 91,6% de pacientes do sexo masculino, com uma média de idade em torno de 47 anos, todos residentes do Estado do Acre. A triagem sorológica foi realizada com a aplicação do teste ELISA, com 102 resultados positivos; destes, doze foram incluídos no estudo e submetidos a testes confirmatórios, dos quais onze tiveram o resultado positivo confirmado. Segundo a avaliação de exames complementares realizados (ECG, ecocardiograma e endoscopia digestiva alta), um doador apresentava a forma cardíaca instalada e os demais a forma indeterminada da doença. É preciso oferecer o exame confirmatório da doença de Chagas na rotina dos bancos de sangue como forma de garantir o encaminhamento oportuno a uma assistência médica qualificada àquele doador de sangue que se tornou paciente chagásico.

Análise das possíveis regiões organizadoras nucleolares e da atividade nucleolar em Triatoma melanocephalae T. lenti, importantes vetores da doença de Chagas

Triatoma melanocephalae T. lentisão espécies crípticas de triatomíneos pertencentes ao subcomplexo Brasiliensis. Esses organismos foram agrupados no subcomplexo apenas por caracteres morfológicos e pela disposição geográfica. Sendo assim, estudos citogenéticos são considerados como importantes ferramentas na classificação dos triatomíneos e, com isso, podem auxiliar na criação de um plano de profilaxia da doença. Por meio da técnica citogenética de impregnação por íons prata, foi possível visualizar a atividade nucleolar e as Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs) desses insetos. T. melanocephalaapresentou três RONs ativas nos autossomos durante a prófase I. T. lenti apresentou duas RONs ativas nos autossomos durante a prófase I e a metáfase I. Ambas as espécies apresentaram o fenômeno de persistência do material nucleolar encontrado em triatomíneos. Sendo assim, por meio da análise das RONs, foi possível observar que T. lenti, quando comparado com os outros organismos do subcomplexo, apresentou marcações semelhantes à T. tibiamaculata e que T. melanocephalanão apresenta nenhuma relação direta com o subcomplexo. Palavras-chave: Citogenética. Taxonomia. Triatominae. Subcomplexo Brasiliensis. ABSTRACT Analysis of nucleolus organizer regions and nucleolar activity in important vectors of Chagas disease (Triatoma melanocephala and T. lenti) Triatoma melanocephalaand T. lentiare important vectors of Chagas disease. These cryptic species of triatomines are grouped in the subcomplexbrasiliensisdue only to morphological characters and geographical distribution. Cytogenetic studies are important to the classification of insects and can assist in creating a disease prevention plan. The aim of the present study was to determine nucleolar activity and nucleolus organizer regions (NORs) in these insects using the cytogenetic method of silver ion impregnation. T. melanocephalaexhibited three active NORs in autosomes during prophase I. T. lentiexhibited two active NORs in autosomes during prophase I and metaphase I. Both species exhibit the persistent nucleolar material found in triatomines. The analysis of NORs in the present study revealed that T. lenti exhibited labeling similar to that found in T. tibiamaculata, which belongs to the subcomplex, whereas T. melanocephalashows no direct relationship with the subcomplex. Keywords: Cytogenetics. Taxonomy. Triatominae. Brasiliensissubcomplex.

Adipocitocinas em portadores da forma indeterminada da doença de Chagas e dislipidemia

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Anticorpos naturais e infecção: anticorpos naturais na doença de Chagas e na paracoccidioidomicose

Using ELISA technique, natural antibodies against self and non self antigens were determined in 80 patients chronically intected by T. cruzi and 40 individuals suffering from a deep mycosis frequentely found in Latin Amarica (Paracoccidioidomycosis - PCM). Two forms of PCM were investigated: adult forms and juvenil type of disease. Eighty percent (80%) of the former group had significantly elevated anti-laminin antibody levels (M=4.7,SD±1.8) compared with healthy controls and different specificities of antibody were associated with anti-laminin in pathological sera. A notable binding to cytoskeletal proteins was observed, specially with band 3 and their peptides derivates, such as 62 kDa peptide. By means of Protein A chromatography we were able to show that natural anti-Gal antibodies may be bound by their Fab region to other immunoglobulins and/or to Protein A by alternative sites of binding. The finding of lgG anti-Gal antibodies in circulating immune complexes isolated from chagasic sera supported the first alternative. However, it is possible that some of lgG anti-Gal antibodies, belong to VH111 subgroup of immunoglobulins, that bind directly to Protein A. Among the 40 sera from PCM examined, the majority was considered as not exhibiting a signilicantly higher binding than normal sera to antigens tested. However thirty percent (30%) of the chronic patients had an increased levels of natural antibodies at least for one specificity such as actyn, myosin and Gala1,3Gal epitopes. ln juvenil type of PCM the mean value found for actyn was also increased 2,42 (range 1,0 to 5,3). Utilizing the polyethylene glicol precipitation the presence of circulating immune complexes was investigated in PCM sera. Specific antibodies for soluble antigens from P. brasiliensis and natural antibodies against myoglobin, myosin and Gala1,3 Gal epitopes were characterized